Στη Συλλογή Ψηφιδωτών του Μουσείου ανήκουν δεκαεννέα τμήματα ψηφιδωτού δαπέδου, που προέρχονται από την τρίκλιτη παλαιοχριστιανική βασιλική κοντά στην κοίτη του ποταμού Ιλισσού. Ο ναός, που βρίσκεται στην Αθήνα, ανατολικά του Ολυμπιείου, πιστεύεται ότι ήταν αφιερωμένος στον μάρτυρα Λεωνίδη και χρονολογείται από τους περισσότερους ερευνητές στον 5ο αιώνα. Τα ψηφιδωτά φέρουν πλούσιο διάκοσμο, που αποδίδεται με λεπτότητα, καλαισθησία και χάρη. Οκταγωνικά διάχωρα περικλείουν ποικίλα γεωμετρικά, φυτικά και ζωικά διακοσμητικά θέματα, όπως πτηνά που ραμφίζουν άνθη, πελαργό που ραμφίζει φίδι κ.ά. Ψηφίδες από μάρμαρο σε πλούσια χρωματική κλίμακα –λευκό, μελανό, ερυθρό, βαθύ ερυθρό, φαιό, πράσινο και ώχρα– καθώς και λιγοστές από υαλόμαζα, κυρίως πράσινου και κυανού χρώματος, έχουν χρησιμοποιηθεί για την απόδοση των διακοσμητικών συνθέσεων.

Στη συλλογή του Μουσείου εντάσσονται ακόμη τμήματα ψηφιδωτού δαπέδου από έπαυλη υστερορωμαϊκών χρόνων στην Αθήνα, που αποκαλύφθηκε κατά την ανασκαφή οικοπέδου (στις οδούς Διονυσίου Αρεοπαγίτου και Προπυλαίων) και καλύπτει από το 1970 το δάπεδο της εισόδου του Μουσείου. Επίσης, τμήμα ψηφιδωτού δαπέδου που χρονολογείται στο α΄ τέταρτο του 5ου αιώνα και βρέθηκε σε οικόπεδο της Αθήνας (στην οδό Ευριπίδου αρ. 67), ανήκε σε κτήριο, πιθανότατα λουτρό, και κοσμεί τον αύλειο χώρο του Μουσείου.